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TÉLÉCHARGER PC TOOLS FILE RECOVER 7.5.0.15 FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching. single text file from The Institute for Genomic Research, and seg- mented into B containing 10 mM TrisHCl (pH ), M NaCl, 1 mM CaCl2, 1. The tunicamycins: useful tools for studies on glycoproteins. Le film est développé après une nuit à température ambiante. Les morpholinos (Gene Tools) sont des oligomères analogues synthétiques M Tris-Hcl pH M NaCl Tween ). of Su(H)DBM on Evi1 but is not sufficient to restore the expression. Catégories du logiciel: Sauvegardes . Dernière modification: TÉLÉCHARGER PC TOOLS FILE RECOVER 7.5.0.15
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Hovasse Agnes 2010

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Chacune de ces PTMs aux fonctions biologiques variables se produit sur des acides amins donns et entrane des diffrences de masse par rapport lacide amin non-modifi.

De mme, des modifications de nature diffrente peuvent engendrer des diffrences de masses trs proches par exemple la phosphorylation et la sulfatation ou la trimthylation et lactylation.

Cela peut rendre lidentification et la localisation de la modification difficile et leur tude par analyse protomique peut rapidement savrer complique. Le cas des glycosylations 1. Les rsidus les plus frquemment observs sont dcrits dans le Tableau 2. Noms, abrviations, symboles et masses des monosaccharides les plus couramment observs dans les structures des glycanes.

Elles reprsentent la majorit des marqueurs de surface cellulaires ainsi que des protines scrtes. Structures chimiques des liaisons sucre-protine pour les O et N-glycosylations Les O-glycosylations: le rsidu monosaccharide se lie la protine par le groupement hydroxyl des rsidus srine Ser, thronine Thr, hydroxyproline Hyp ou hydroxylysine.

La plus rpandue est la O-glycosylation de type mucine o le rsidu N-acetylglucosamine GlcNAc du glycane se lie la srine ou la thronine. Les N-glycosylations: le glycane est attach la protine par le groupement amide dune asparagine Asn via le rsidu N-actylglucosamine GlcNAc. Dans la suite de ce chapitre nous nous intresserons plus particulirement au cas des N- glycosylations. Le GlcNAc proximal est fix sur lasparagine de la squence consensus. En effet, ce quon appelle une glycoprotine est en fait un mlange de trs nombreuses molcules qui peuvent avoir des fonctions biologiques trs diffrentes, bien quelles aient toutes exactement la mme squence en acides amins.

Cette htrognit est donc uniquement lie des diffrences de glycosylations. Pourtant ce site peut ne pas tre occup par une glycosylation. Cest ce quon appelle la macro-htrognit dune glycoprotine. Ensuite, chaque site consensus glycosyl peut porter plusieurs glycanes diffrents longueur des antennes, ramification, etc. Ceci correspond la micro-htrognit.

Toutes les structures glycaniques reprsentes Figure 3a sont fixes sur lasparagine en position 292 de lovalbumine dans les proportions indiques sur le diagramme Figure 3b. Analyse des glycoprotines entires 2. Une des phases stationnaires les plus communes est constitue de lectine fixe sur de la spharose ou de lagarose.

Les lectines sont des protines qui interagissent de manire slective avec un type de glycoforme sans le modifier. Analyse de glycoprotines entires par spectromtrie de masse La caractrisation des glycoprotines intactes par spectromtrie de masse pose un certain nombre de difficults qui sont lies leur htrognit.

Des glycoprotines aux glycopeptides La caractrisation des glycoprotines passe par la dtermination de la squence primaire de la protine, des sites de glycosylations et enfin des glycoformes avec les micro-htrognits. Il ainsi possible dobtenir des informations de squence la fois pour le peptide et le glycane.

Nanmoins la squence en acides amins du glycopeptide nest que rarement dtermine dans sa totalit. Ces deux mthodes ncessitent lutilisation dune endoprotase afin de digrer la glycoprotine en peptides et glycopeptides. De plus, une tape denrichissement du digestat en glycopeptides peut tre ncessaire. La squence peptidique des glycopeptides gnrs est donc prvisible. De plus certains glycopeptides peuvent contenir plusieurs sites de glycosylations. Il existe un grand nombre de mthodes permettant de fractionner ou denrichir un chantillon en glycopeptides.

Les glycopeptides tant plus hydrophiles que les peptides non glycosyls, ils vont tre lus plus tard que sur une phase inverse C18. Il est alors possible de rcuprer la fraction ou de coupler la chromatographie avec un spectromtre de masse quip dune source nano-ESI. Cela permet une analyse directe de lchantillon enrichi en glycopeptides.

Cette technique permet de dessaler et de concentrer lchantillon en glycopeptides. Pourtant en pratique, les glycopeptides sont souvent analyss directement partir du digestat total donc dans un mlange complexe de peptides et de glycopeptides. La mthode enzymatique a pour avantage de conserver la fois le glycane et le peptide intact. Dans ce cas il est possible dutiliser la PNGase A. Ce type denzyme coupe la liaison entre le GlcNAc et lasparagine.

Il existe galement des endoglycosidases qui coupent la liaison glycosydique entre les deux rsidus GlcNAc du tronc commun. La plus couramment utilises est lendoglycosydase H endo H qui libre les high-mannoses et une grande partie des glycanes de type hybrides. Le site de glycosylation est ainsi trs clairement marqu. Toutes ces tapes demandent du temps et surtout une quantit de matriel importante.

De plus linformation sur la micro-htrognit est perdue. En effet, les glycopeptides sont plus difficiles ioniser par la technique dlectrospray habituellement utilise que les peptides non glycosyls. De plus, comme les structures glycaniques sont trs htrognes le signal en spectromtrie de masse est rparti sur de nombreux ions molculaires dont lintensit est bien plus faible que celle du peptide correspondant non glycosyl.

Par consquent, ils sont en gnral, particulirement difficiles dtecter. Il sagit de dtecter les glycopeptides dans le spectre de masse laide dions spcifiques de la fragmentation des glycosylations. Ces ions sont gnralement nomms "ions diagnostiques" ou "ions marqueurs". Dtection des glycopeptides grce aux ions diagnostiques Les ions diagnostiques sont gnrs par fragmentation prfrentielle des liaisons osidiques qui sont plus faibles que les liaisons peptidiques.

Les ions diagnostiques sont de type B et Y. Nomenclature de fragmentation des polysaccharides Domon et Costello, Pour les fragments de type Ai et Xi, les numros en exposants correspondent des fragmentations intracycliques. Ils sont issus de la fragmentation interne du glycane et ont donc des masses molculaires diffrentes en fonction du type de glycosylation.

La littrature montre, en fait, que les ions diagnostiques nont que peu t utiliss dans la stratgie de caractrisation des glycoprotines. Nous pensons que les mthodes instrumentales pour former ces ions doivent encore tre optimises, surtout avec les progrs instrumentaux en termes de sensibilit, de prcision de mesure de masse et de rsolution. Le chapitre 2 des rsultats sera consacr ce point. Lanalyse MS n des glycopeptides La fragmentation des N-glycopeptides permet de dterminer la composition de chaque glycane sur chaque site de glycosylation mais galement de dterminer le site de glycosylation.

Dans certains cas, il est possible dobserver des ions correspondant la fragmentation du peptide non glycosyl permettant didentifier la squence en acides amins du peptide Figure 11A. Nanmoins, la liaison glycosidique tant beaucoup plus labile que la liaison peptidique, les fragments les plus intenses correspondent des pertes successives de sucres sur le glycopeptide, et la prsence dions fragments correspondant au peptide sont peu intenses voire inexistants.

La Figure 11 montre les spectres de fragmentation dun glycopeptide basse Figure 11A et haute nergie Figure 11B. A basse nergie, les ions observs correspondent majoritairement la fragmentation du glycane. A haute nergie, les ions gnrs correspondent la fragmentation de la partie peptidique et permettent ainsi dobtenir la squence du peptide. Des problmes se posent galement en ce qui concerne la compatibilit avec les formats des listes de masses. En effet, la fragmentation par ETD tant non ergodique elle permet de prserver les liaisons osidiques tandis que le squelette peptidique est fragment en gnrant principalement de ions c et z Figure 12.

Conclusion La glycosylation fait partie des modifications port-traductionnelles les plus courantes. Elle possde un rle majeur dans la fonction biologique des protines. Cependant, la caractrisation des glycoprotines reste complexe en grande partie cause de leur grande htrognit. Afin de caractriser finement les protines N-glycosyles, plusieurs critres sont prendre en compte comme: la quantit de matriel, la taille de la glycoprotine, son htrognit et quelle est prcisment linformation recherche.

Ainsi, la caractrisation de protines N-glycosyles ncessite la mise en place dune mthodologie combinant plusieurs techniques aussi bien au niveau de la prparation dchantillon, de lacquisition des donnes MS, que de leur interprtation. Chacune de ces tapes demande une grande expertise et doit tre adapte au contexte de ltude. De nombreuses mthodologies existent dj pour la caractrisation des protines N- glycosyles.

Nous avons utilis dans la suite de ce travail les ions diagnostiques forms partir de glycopeptides. Ces ions diagnostiques permettent de localiser dans le courant dions total les spectres correspondants des glycopeptides mineurs. La littrature montre en fait que les ions diagnostiques ont t trs peu utiliss dans la stratgie de caractrisation des glycoprotines dans les cas dchantillons en trs faibles quantits par exemple extrait de bandes de gel 1D ou 2D.

Cest pourquoi nous avons consacr un chapitre lamlioration de la formation et de la dtection de ces ions diagnostiques de ces glycopeptides. Prparation dchantillon Sparation des protines et des peptides Analyse par spectromtrie de masse Identification Caractrisation Quantification Prparation dchantillon Sparation des protines et des peptides Analyse par spectromtrie de masse Identification Caractrisation Quantification Figure 1.

Une fois les ions produits dans la source, ils sont transfrs jusqu lanalyseur laide de gradients de pression et de champs lectriques. Plusieurs analyseurs peuvent tre combins, on parle alors de spectromtrie de masse en tandem. Ce type de configuration permet dobtenir des informations structurales par exemple par fragmentation induite par collision CID.

Ces techniques ont rendu possible le transfert de biomolcules intactes en phase gazeuse pour lanalyse par spectromtrie de masse. John Fenn et Koichi Tanaka ont t rcompenss par un prix Nobel de chimie en pour leurs travaux sur ces nouvelles mthodes dionisation. La source lectrospray ESI 1. Ces sources miniaturises permettent de rduire la consommation dchantillon tout en amliorant la sensibilit, elles sont donc particulirement bien adaptes pour les analyses protomiques.

Les matrices les plus couramment utilises en protomique sont lacide -cyano-4-hydroxycinnamique et lacide 2,5-dihydrobenzoque DHB. La qualit des spectres dpend de plusieurs facteurs lis la prparation de lchantillon comme le choix de la matrice, la mthode de dpt pour la co-cristallisation matrice-analyte ou le pH des solutions.

Les ions gnrs sont majoritairement monochargs. Ainsi les ions peuvent tre isols en fonction de leur masse. Les ions circulent dans cet espace en empruntant les orifices situs au centre de chaque lectrode chapeau. Il est ainsi possible de raliser des analyses MS n. La trappe ionique prsente une grande capacit de pigeage des ions et donc une grande sensibilit. En revanche, les trappes ioniques pchent par leur rsolution limite environ et leur faible justesse de mesure de masse.

Les ions entrent tous dans le tube de vol libre de champ avec la mme nergie cintique zeE. Etant donn que cette dernire est gale mv, la vitesse des ions est inversement proportionnelle la racine carre de leur masse et proportionnelle la racine carre de leur charge.

Un spectre de masse est gnr aprs avoir mesur le temps de vol de chaque ion. Il slectionne les ions prcurseurs qui sont ensuite fragments dans la cellule de collision. On parle alors de spectromtre de masse en tandem. Enfin, les analyseurs TOF sont en thorie illimits en gamme de masse. En effet la bonne dynamique au niveau de la gamme de masse permet de voir correctement des ions lourds comme des glycopeptides et des ions lgers comme des ions oxoniums issus de la fragmentation des glycosylations.

Les spectres de fragmentation sont galement trs informatifs en ce qui concerne les modifications post-traductionnelles comme les glycosylations. La nomenclature propose par Biemann reste toujours celle utilise officiellement Figure 8. Nomenclature de fragmentation des polysaccharides.

La prsence de ce proton initie une fragmentation au niveau des liaisons amides ou liaisons peptidiques pour former des ions b et y. Pour des peptides monochargs, la prsence dacides amins basiques Arginine, Lysine augmente considrablement lnergie ncessaire leur fragmentation: le proton est "squestr" sur la chane latrale de lacide amin basique et lnergie requise pour le dlocaliser sur le squelette peptidique est plus leve.

Les ions y sont souvent plus intenses car le proton squestr par le rsidu C-terminal augmente leur stabilit par rapport aux ions b. Dans le cas des glycopeptides, les liaisons osidiques sont plus faibles que les liaisons peptidiques.

Le glycane fragmente donc prfrentiellement au dtriment du peptide Chapitre 1. Ce processus de fragmentation ne suit pas le chemin nergtique prfrentiel pour la dissociation des molcules. Les ions rsultants de cette fragmentation sont de type c et z. Cette fragmentation statistique permet de conserver les modifications post-traductionnelles comme les glycosylations. Pourtant, mme si ces spectres sont trs informatifs, ils sont galement assez complexes interprter.

Les stratgies protomiques bases sur les techniques sparatives La spectromtrie de masse ne peut, elle seule, permettre la caractrisation directe de mlanges complexes de protines. En effet, ces protines peuvent tre prsentes sous de multiples isoformes et porter des modifications post-traductionnelles.

Godin, D.A. and recovery from ischemic stroke. Amedee. la mme sans toi, et nos ordi non plus d ailleurs), la tout aussi indispensable Danile Thierse, Fabrice Bertile (les amricains pendant ce temps l), Cyril Colas. New chemical and biological tools for targeting in cancer imaging and of heparanase solution ( ng mL heparanase in Tris-HCl pH , M NaCl and CHAPS). Belafsky, P.C. "Tools for glycoproteomic analysis: size exclusion chromatography facilitates identification "Quantitative Analysis of Proteome Coverage and Recovery Rates for downloaded as a single text file from The Institute for Genomic Research, and Tris HCl (pH ), M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 MnCl2 at room temperature. Woodworth, B.A. Scandurro, A.B. Fitzpatrick, P.C.

Un fractionnement des chantillons avant leur analyse par spectromtrie de masse est alors requis pour que leur complexit soit compatible avec les performances des instruments utiliss.

La Figure 10 dcrit les techniques sparatives les plus utilises en analyse protomique. Cette technique consiste sparer les protines, contenues dans un chantillon complexe, en fonction de leur point isolectrique pI selon une premire dimension iso-lectrofocalisation, IEF, puis en fonction de leur masse molculaire selon une deuxime dimension lectrophorse SDS- PAGE.

Bien que trs utilise cette technique possde quelques limitations. Le grand nombre de spots gnrs rend difficile la dcoupe systmatique des gels 2D. Gnralement seuls les spots les plus intenses sont donc analyss. Pourtant le gel 2D reste une mthode de choix pour lanalyse protomique car il est trs rsolutif et donne des indications quantitatives.

Contrairement au gel 2D, cette technique permet de sparer tous types de protines quels que soient leurs proprits physico-chimiques. Cependant, son pouvoir rsolutif reste relativement faible. Sur un extrait biologique complexe plusieurs centaines de protines peuvent co-migrer dans la mme zone du gel. Sparation des protines par chromatographie liquide LC Dans le cas de mlanges peu complexes, les protines peuvent tre spares par simple chromatographie liquide.

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Elle est en effet trs rsolutive, flexible, et permet un couplage direct avec un spectromtre de masse via une source lectrospray.

Mais la chromatographie de phase inverse RPLC avec un greffage C18 est la principale mthode sparative utilise pour les peptides. La sparation des peptides par nano-chromatographie liquide nanoLC Actuellement la mthode la plus classiquement utilise pour la sparation de peptides est la RPLC.

La rsolution chromatographique ainsi que la sparation des peptides sont dtermins par le gradient chromatographique, mais surtout par le type de colonne utilise taille des particules, type de phase stationnaire, longueur, diamtre, taille des pores. En revanche ce type de colonne ncessite un systme chromatographique adapt car rduire la taille des particules provoque une importante augmentation de pression nanoAcquity UPLC Waters par exemple.

Ce systme sera dtaill dans la partie Rsultats Partie 1 chapitre 1. Le principe de la chromatographie multidimensionnelle consiste coupler des systmes de chromatographie bass sur des mcanismes de rtention diffrents pour obtenir des sparations en thorie orthogonales entre les diffrentes dimensions du systme. La plupart du temps cette sparation est effectue en 2 dimensions. Il est donc impossible de distinguer des isoformes ou des htrognits au niveau des modifications post-traductionnelles.

Ces masses sont ensuite compares celles de peptides thoriques obtenus partir de la digestion in silico des protines prsentes dans une banque de squences Figure 11. Gnralement, la stratgie PMF est utilise pour identifier des protines contenues dans un extrait peu complexe comme un spot de gel 2D par exemple. Cette stratgie prsente de nombreux avantages par rapport la stratgie PMF. Cette approche est base sur la comparaison des listes de masses des ions parents et fragments mesurs avec des ions parents et fragments thoriques contenus dans une banque protique Figure 12.

Une autre stratgie doit alors tre adopte: le squenage de novo. Malgr ces logiciels, cette approche reste trs couteuse en temps et ncessite des spectres de fragmentation de trs bonne qualit. Les banques de donnes Les identifications et les interprtations biologiques qui dcoulent des analyses protomiques dpendent directement de la disponibilit de banques de squences et de la qualit de leur annotation.

Chacune est caractrise par son exhaustivit, son degr de redondance, la qualit de ses annotations. On peut ainsi distinguer deux catgories de banques protiques: 1. Les banques gnralistes de dpt contenant essentiellement des squences protiques issues de la traduction de gnes prdits in silico par des algorithmes de prdiction sans vrification et avec des annotations fonctionnelles limites voire inexistantes.

Elle contient galement des squences protiques issues de publications ou dposes directement par les utilisateurs. Cette banque gnraliste se trouve la jonction des deux types de banques. Evaluation des rsultats Les scores calculs par les moteurs de recherche ne constituent pas des indicateurs suffisamment fiables pour considrer la pertinence des identifications.

La stratgie "Target-Decoy" ne permet pas de dterminer exactement quelles identifications sont correctes ou non mais elle value le taux de faux positifs FDR.

Illustrations de la validit des identifications en fonction du seuil de score. Unidimensional high performance liquid chromatography. Ce compromis ne peut tre obtenu qu condition de comprendre lincidence de tous les paramtres aussi bien de la partie chromatographique que de ceux du spectromtre de masse. Nous sommes souvent en "limite" de performances pour les analyses effectues sur ce systme, et avant de raliser une exprience, il est absolument primordial de savoir si le couplage utilis offre ses capacits maximales avec les paramtres slectionns pour lchantillon analyser.

Ces connections constituent le point faible de ce type de systme. De plus chaque connexion est une source potentielle de fuite.

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Enfin, les aiguilles de nbulisation utilises avec les sources nanospray on-line sont fragiles, elles ont des dures de vie trs variables, et sont dlicates mettre en place.

Le rotor est constitu de deux parties Figure 2C. Optimisation des conditions chromatographiques 2. Ce systme ayant volu amlioration de la rsolution des colonnes, capacit des colonnes de chargement, meilleure stabilit du nanospray, volution des performances du spectromtre de masse, il a t ncessaire de reprendre ltude de linfluence des principaux paramtres dbit, gradient, nature du modifieur organique de la phase mobile, etc.

Plusieurs dbits ont t tests. Plusieurs gradients linaires ont donc t tests en injectant un digestat trypsique de BSA. Ce systme est donc trs consommateur en solvant. La contrepression gnre par son utilisation comme phase mobile est donc plus importante. La seule diffrence est la nature du solvant organique actonitrile ou mthanol. Par consquent, un temps t, la consigne donne ne correspond pas la composition relle en solvants.

Rsolution chromatographique Un gradient est dvelopp pour effectuer des analyses avec une colonne longue 150 mm en prenant comme modle celui ralis pour les colonnes courtes 43 mm Figure 7. Ce gradient plus rapide a galement pour avantage de raccourcir la dure des analyses.

Les gouttelettes formes dans la source nano- spray possdent donc une tension de surface plus faible. Aprs optimisation du gradient, la sparation et la rsolution chromatographique sont semblables pour les deux solvants. Ils analysent un digestat trypsique de cinq protines modles en utilisant les mmes contions chromatographiques pour les trois solvants. De plus leur travail montre une diminution du nombre de peptides identifis et des pourcentages de recouvrement.

Optimisation des paramtres de la trappe ionique 3. Chaque analyse a t ralise 3 fois. En effet, avec une trappe ionique lorsque la vitesse de balayage augmente, la sensibilit est accrue mais en contrepartie la rsolution diminue. Par exemple pour les mthodes dveloppes pour la vrification du couplage, 3 parents sont slectionns par spectre MS. Cet chantillon modle est peu complexe et parfaitement squenc dans les banques protiques.

Pour cela, le nombre de spectres moyenn est diminu au maximum soit 1 moyenne. Dans ce cas, un spectre correspond une fragmentation. Cette mthode convient parfaitement pour des mlanges peu complexes comme des spots de gel 2D, mais doit bien sre tre adapte en fonction des chantillons et de la question pose.

Chacune de ces tapes peut induire une erreur. Les optimisations prcdemment dcrites ont alors permis de dvelopper un ensemble de tests complmentaires permettant de vrifier les performances de chacune des composantes du couplage tant au niveau chromatographique que du spectromtre de masse, mais permettant galement de faciliter le diagnostique en cas de panne.

Ils doivent donc tre rapides et simples raliser tout en permettant une vrification complte du couplage. Le digestat trypsique de BSA est conserv comme chantillon modle.

Des valeurs seuils sont dtermines exprimentalement pour chaque paramtre et servent de rfrence. Par exemple, pour une analyse sur une colonne de 150 mm, il doit y avoir au minimum 7 min entre les temps de rtention des deux ions de rfrence. Chacun des paramtres de mesure sont dcrits dans la suite de ce chapitre.

Ils permettent galement de calculer la diffrence de temps de rtention entre les 2 ions 4. Intensit des pics chromatographiques Cette mesure donne une indication sur la sensibilit du systme. Ce paramtre est donc particulirement critique. Diffrence entre les temps de rtention des deux ions de rfrence Le suivit de la diffrence entre les temps de rtention des ions de rfrence permet de dterminer la qualit de la sparation chromatographique.

Cette dernire mesure correspond au but de toute analyse protomique, soit connaitre les protines prsentes dans un chantillon biologique. Dans ce cas le test peut consister identifier un nombre minimal de protines. Pour cela, les valeurs seuils ont t redfinies en fonction des performances de chaque instrument. Nouveaut instrumentale: la trappe amaZon Au cours de ce travail, la nanoLC-chip a t couple avec une nouvelle gnration de trappe ionique amaZon, Bruker Daltonics.

Les principales amliorations apportes sur ce spectromtre de masse sont: la sensibilit, la vitesse de balayage, la rsolution, la qualit des spectres de fragmentation. Nous avons donc adapt les rglages du spectromtre de masse aux nouvelles capacits de cet instrument et redfini les valeurs seuils pour les tests de performance du couplage nanoLC-Chip 5. Schma de la trappe ionique amaZon 5.

Enfin, le mode "Standard Maximum" est devenu le mode "Maximum Resolution" en multipliant par 6 sa vitesse de balayage. Rsolution spectrale Avec les instruments de type trappe ionique, la vitesse de balayage est directement lie la rsolution spectrale. On observe que la rsolution diminue quand la vitesse de balayage augmente.

En mode "UltraScan" il est possible de distinguer un ion doublement charg mais pas un triplement charg pour cette gamme de masse. Enfin, le mode "Maximum Resolution" ne gnre pas un gain de rsolution significatif pour les ions slectionns.

Pourtant, on a pu observer une amlioration de la rsolution. Conclusion La nouvelle gnration de trappe ionique amaZon a permis un net gain en sensibilit, en rsolution et en vitesse de balayage par rapport la gnration prcdente. Notre travail a port sur lutilisation de lactonitrile ainsi que du mthanol comme modifieur de la phase mobile.

Nous avons montr que lutilisation du mthanol permettait dobtenir une meilleure sensibilit quavec lactonitrile. Ce dernier rsultat est important parce que laugmentation du taux de recouvrement est lobjectif final de toute optimisation pour une analyse protomique.

Des valeurs seuils ont t dtermines exprimentalement pour chaque grandeur et servent de critre pour dterminer ltat du systme. Les tests utiliss en complment de la seule mesure du taux de recouvrement nous permettent davoir une vision trs fine de ltat du systme et de dtecter des drives lgre fuite, problme de pompage, lgre perte linjection, dgradation de la rsolution chromatographique.

Ce suivi du systme complet permet donc de mettre toutes les chances de notre ct pour prvenir une panne qui pourrait survenir pendant une srie danalyse dchantillons prcieux. Chacune des quipes a du analyser une mlange de 20 protines recombinantes en quantits quimolaires. Les rsultats ont ensuite t compars. Plusieurs types de spectromtres de masses gomtrie, gnration, constructeur, etc et des moteurs de recherches diffrents ont t utiliss.

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Pour obtenir les donnes de protomique recherches, nous avons dvelopp des mthodologies spcifiques ltude des glycoprotines rencontres. Cette mthode a t optimise et teste sur plusieurs spectromtres de masse disponibles au laboratoire afin de comparer leurs performances et de choisir le plus adapt pour nos analyses.

Lobjectif tait bien sr de parvenir la sensibilit la plus leve possible pour la dtection de tous les glycopeptides prsents. Une glycoprotine modle: lalpha-1 glycoprotine acide humaine AGP Pour optimiser notre stratgie, nous avons utilis une protine modle appele alpha-1 glycoprotine acide humaine que nous appellerons AGP dans la suite de ce manuscrit dans un but de simplification. Cette protine plasmatique possde deux rles principaux qui sont le transport de substance endognes ou exognes et une fonction de modulation immunologique.

Cette glycoprotine est purifie partir du srum et est disponible commercialement. En effet, elle possde 5 sites Asn-15, 38, 54, 75 et 85 qui portent des N-glycosylations de type complexe. Les squences et les masses des peptides trypsiques portants des sites consensus de glycosylation et correspondants ces isoformes sont dcrites dans le Tableau 1. Nous appellerons ces ions "ions diagnostiques" dans la suite de ce manuscrit.

Structures et symboles des principaux ions oxoniums gnrs par la fragmentation des glycosylations de type complexes et sialyles utiliss comme ions diagnostiques.

La transferrine a une masse denviron 77 kDa et possde 2 sites de glycosylations. Les deux glycopeptides sont donc "noys" au milieu de la cinquantaine de peptides trypsiques gnrs par la digestion enzymatique de la glycoprotine. Dans cette analyse, ralise sans optimisation particulire, le deuxime glycopeptide na pu tre dtect. Ceci est d sa masse trop leve environ Da pour les conditions utilises comme le montreront les tudes dcrites dans la suite de ce chapitre.

Une partie de mon travail a consist comparer et optimiser ces deux modes de fragmentation sur plusieurs spectromtres de masse disponibles au laboratoire afin de dterminer la mthode la plus efficace pour gnrer des ions diagnostiques. Dveloppements mthodologiques pour la dtection et la caractrisation des protines N-glycosyles - 107 - Capillaire de transmission F l u x d. Source Analyseur Skimmer 1 bar 5,5 mbar 1. Dans le cas des glycopeptides, cela permet de gnrer des ions diagnostiques.

Les paramtres critiques optimiser sont: la tension applique au niveau du Cap Exit, la gamme de balayage et les paramtres rgissant la transmission des ions. Une premire exprience a t effectue en infusant une fraction purifie de glycopeptides trypsiques dAGP. La seule solution reste le nettoyage du capillaire de transmission et du skimmer aprs chaque srie danalyse, ce qui est fastidieux et risque dendommager le spectromtre de masse. En effet, les dmontages et remontages rpts de linterface finissent par entrainer des dommages mcaniques connexions, micro-soudure, capillaires, contacts lectriques.

Interface comprenant un capillaire de transmission et des funnels Cette interface possde une gomtrie relativement proche de celle dcrite dans le paragraphe prcdent. En effet, elle comprend un capillaire de transmission similaire celui dcrit ci-dessus. La principale diffrence se situe aprs le capillaire. Dans cette interface, le skimmer est remplac par deux sries de lentilles qui sont appeles funnels Figure 7 sur lesquelles sont appliqus des potentiels dcroissants et qui permettent une meilleure focalisation des ions la sortie du capillaire de transmission.

De plus, les orifices des lentilles sont lgrement dcentrs par rapport la sortie du capillaire de transmission. Ainsi, seuls les ions qui sont focaliss par les champs lectriques gnrs par les lentilles sont transmis. Tous les ions ngatifs ou les molcules neutres vont scraser sur le funnel 1. Le funnel 2 permet ensuite de refocaliser les ions et donc de limiter une perte de sensibilit due la fragmentation.

Plusieurs nergies sont testes 0 100 eV. Les intensits indiques dans le graphique de la Figure 8C correspondent des valeurs moyennes releves sur lensemble de lanalyse.

Nanmoins, comme le montre la Figure 9B, basse nergie, les ions diagnostiques restent faibles et les glycopeptides sont suffisamment intenses pour tre identifis. Ainsi, les espces neutres ou charges ngativement entrent en collision avec les parois de linterface. Ce systme permet de filtrer finement les ions et ainsi dobtenir un bruit de fond de faible intensit ainsi quun encrassement plus limit du spectromtre de masse. Dveloppements mthodologiques pour la dtection et la caractrisation des protines N-glycosyles - 111 - Lnergie applique au niveau du cne dchantillonnage est dterminante pour une bonne transmission des ions.

Dans des conditions standards pour des analyses protomiques, elle est fixe 35 V. En augmentant cette tension il est possible de fragmenter les ions et ainsi dobtenir des ions diagnostiques lors de lanalyse de glycopeptides. Les rsultats obtenus sont illustrs dans la Figure 11.

Lintensit des ions diagnostiques augmente de faon constante pour des tensions allant de 5 70 V.

Ainsi le phnomne de fragmentation en source se manifeste mme pour des tensions de cne trs basses Figure 11A. Bien que leur intensit maximale soit obtenue aux alentours de 60 V Figure 11B, les ions diagnostiques sont parfaitement dtectables ds 20 V.

Si lon cherche identifier des glycopeptides entiers, il est ncessaire de faire un compromis entre une bonne transmission des ions et un minimum de fragmentation en source. En revanche, les glycopeptides ragissent diffremment. Au del de 30 V leur intensit chute car ils se fragmentent. Peptides non glycosyls Glycopeptides 0,0 500,0 ,0 ,0 ,0 ,0 10 20 30 40 50 60 I n t e n s i t. La tension de cne pour obtenir une intensit optimale des ions diagnostiques est de 60 70 V.

La profondeur du puits augmente avec la taille des ions analyser et il est difficile de piger efficacement la fois les ions de bas et de haut poids molculaire. Enfin, la prcision de mesure de masse 0,25 Da et la rsolution des analyseurs de type trappe ionique est assez basse 700 de rsolution pour les ions monochargs 366 et 657 sur la trappe HCT Plus et peut provoquer une ambigit dans lidentification des ions diagnostiques particulirement dans le cas de mlanges complexes.

Cet instrument est galement plus sensible dun facteur 10 par rapport la gnration prcdente HCT Ultra, Bruker Daltonics. Sur les Q-TOF la gamme dynamique au niveau de la mesure de masse est uniquement limite par le quadriple car en thorie, les analyseurs TOF ont une gamme de masse illimite.

Les ions diagnostiques sont donc parfaitement visibles dans les spectres de fragmentation. With respect to cancer, the presence of a relatively high amount of transcript in biopsied tissue from an individual may indicate a predisposition for the development of the disease, or may provide a means for detecting the disease prior to the appearance of actual clinical symptoms. A more definitive diagnosis of this type may allow health professionals to employ preventative measures or aggressive treatment earlier thereby preventing the development or further progression of the cancer.

For example, patients can be administered a polypeptide of the present invention in an effort to replace absent or decreased levels of the polypeptide e.

In particular, albumin fusion proteins comprising of at least a fragment or variant of a Therapeutic antibody can also be used -to treat disease as described -supra, and elsewhere herein. Similarly, administration of an albumin fusion protein comprising of at least a fragment or variant of a Therapeutic antibody can activate the polypeptide to which the Therapeutic antibody used to make the albumin fusion protein immunospecifically binds, by binding to the polypeptide bound to a - membrane receptor.

Moreover, the albumin fusion proteins of the present invention can be used to test the biological acti vities described herein.

Thus, the invention provides a diagnostic method useful during diagnosis of a disorder, which involves measuring the expression level of the gene encoding a polypeptide in tissues, cells or body fluid from an individual and comparing the measured gene expression level with a standard gene expression level, whereby an increase or decrease in the gene expression level s compared to the standard is indicative of a disorder.

These diagnostic assays may be performed in vivo or in vitro, such as, for example, on blood samples, biopsy tissue or autopsy tissue. The present invention is also useful as a prognostic indicator, whereby patients exhibiting enhanced or depressed gene expression will experience a worse clinical outcome By "assaying the expression level of the gene encoding a polypeptide" is intended qualitatively or quantitatively measuring or estimating the level of a particular polypeptide e.

As will be appreciated in the art, once a standard polypeptide level or mRNA level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison. By "biological sample" is intended any biological sample obtained from an individual, cell line,-tissue culture, or other source containing polypeptides of the invention including portions thereof or mRNA.

As indicated, biological samples include body fluids such as sera, plasma, urine, synovial fluid and spinal fluid and tissue, sources found to express the full length or fragments thereof of a polypeptide or mRNA. Where the biological sample is to include mRNA, a tissue biopsy is the preferred source.

Levels of mRNA encoding the polypeptides of the invention are then assayed using any appropriate method. The present invention also relates to diagnostic assays such as quantitative and diagnostic assays for detecting levels of polypeptides that bind to, are bound by, or associate 78 CA with albumin fusion proteins of the invention, in a biological sample e.

Thus, for instance, a diagnostic assay in accordance with the invention for detecting abnormal expression of polypeptides that bind to, are bound by, or associate with albumin fusion proteins compared to, normal control tissue samples may be used to. Assay techniques that can be used to determine levels of a polypeptide that bind to, are bound by, of associate with albumin fusion proteins of the present invention in a sample derived from a host are well-known to those of skill in - the art.

Assaying polypeptide levels in a biological sample can occur using any art known method. Assaying polypeptide levels in a- biological sample can occur using a variety of techniques..

Other methods useful for detecting 15- polypeptide gene expression include immunoassays. The tissue or cell type to be analyzed will generally include those- which are known, or suspected, to express the gene of interest such as, for example, cancer.

The protein isolation methods employed herein may, for example, be such as those described in Harlow and Lane Harlow, E. The isolated cells-can be derived from cell culture or from a patient. The analysis of cells taken from culture may be a necessary step in the assessment of cells that could be used as part of a cell-based gene therapy technique or, alternatively, to test the effect of compounds on the expression of the gene.

For example, albumin fusion proteins may be used to quantitatively or qualitatively detect the presence of polypeptides that bind to, are bound by, or associate with albumin fusion proteins of the present invention.

This can be accomplished, for example, by immunofluorescence techniques employing a fluorescently labeled albumin fusion protein coupled with light microscopic, flow cytometric, or fluorimetric detection. In a preferred embodiment, albumin fusion proteins comprising at least a fragment or variant 6f -an antibody that immunospecifically binds at least a Therapeutic protein disclosed herein e.

This can be -accomplished, for example, by immunofluorescence techniques employing a fluorescently labeled antibody coupled with light microscopic, flow cytometric, or fluorimetric detection. The albumin fusion proteins of the present invention may, additionally, be employed histologically, as in immunofluorescence, immunoelectron microscopy or non- immunological assays, for in situ detection of polypeptides that bind to, are bound by, or associate with an albumin fusion protein of the present invention.

In situ detection may be accomplished by removing a histological specimen from a patient, and applying thereto a labeled- antibody or polypeptide of the present invention. The albumin fusion proteins are preferably applied by overlaying the labeled albumin fusion proteins onto a biological sample. Through the use of such a procedure, it is possible to determine not only the presence of the polypeptides that bind to, are bound by, or associate with albumin fusion proteins, but also its distribution in the examined tissue.

Using the present invention, those of ordinary skill will readily perceive 15. Immunoassays and non-immunoassays that detect polypeptides that bind to, are bound by, or associate with albumin fusion proteins will typically comprise incubating a sample, such as a biological fluid, a tissue extract, freshly harvested cells, or lysates of cells which have been incubated in cell culture.

The support may then be washed with suitable buffers followed by treatment with- the detectably labeled albumin fusion protein of the invention. The solid phase support may then be washed with the buffer a second time to remove unbound: antibody or polypeptide. Optionally the antibody is subsequently labeled. The amount of bound label on solid support may then be detected by conventional means.

By "solid phase support or carrier" is intended any support capable of binding a polypeptide e. The nature of the carrier can be either soluble to some extent or insoluble for the purposes of the present invention..

The support material may have virtually any possible structural configuration so long as the coupled molecule is capable of binding to a polypeptide. Thus, the support configuration may CA be spherical, as in a bead, or cylindrical, as in the inside surface of a test tube, or the external surface of a rod. Alternatively, the surface may be flat such as a sheet, test strip, -etc. Preferred supports include polystyrene beads.

Those skilled in the art will know many other suitable carriers for binding antibody or antigen, or will be able to ascertain the same by use of routine experimentation. Those skilled in the art will be able to determine operative and optimal assay conditions for each determination by employing routine experimentation. In addition to assaying polypeptide levels in a biological sample obtained from an individual, polypeptide can also be detected in vivo by imaging. For example, in one embodiment of the invention, albumin fusion proteins of the invention are used to image diseased or-neoplastic cells.

For X-radiography, suitable labels include radioisotopes such as barium or cesium, which emit detectable radiation but are not overtly harmful to the subject. Suitable markers for NMR and ESR include those with a detectable characteristic spin, such as deuterium, which may be incorporated into the albumin fusion protein by labeling of nutrients of a cell line or bacterial or yeast strain engineered.

Additionally, albumin fusion proteins of the invention whose presence can be detected, can be administered. For example, albumin fusion proteins of the invention labeled with a radio-opaque or other appropriate compound can be administered and visualized in vivo, as discussed, above for labeled antibodies. Further, such polypeptides can be utilized for in vitro diagnostic procedures. It will be understood in the art that the size of the subject and the imaging system used will determine the quantity.

In the case of a radioisotope moiety, for a human subject, the quantity of radioactivity injected will normally range from about 5 to 20 millicuries of 99Tc. The labeled albumin fusion protein will then preferentially accumulate at the locations in the body which, contain a polypeptide or other substance that binds- to, is bound by or associates with an albumin fusion protein of the present invention. In vivo tumor imaging is described in S.

Burchiel and 81 CA B. One of the ways in which an albumin fusion protein of the present invention can be detectably labeled is by linking the same to a reporter enzyme and using the linked product in an enzyme immunoassay EIA Voller, A. The reporter enzyme which is bound to the antibody will react with an appropriate substrate, preferably a chromogenic substrate, in such a manner as to produce a chemical moiety which can be detected, for example, by spectrophotometric, fluorimetric or by visual means.

Additionally, the detection can be. Detection may also be accomplished by visual comparison of the extent of enzymatic reaction of a substrate in comparison with similarly prepared standards. Albumin fusion proteins may also be. For example, by radioactively labeling the albumin fusion proteins, it is possible to the use the albumin fusion proteins in a radioimmunoassay RIA see, for example, Weintraub, B.

The radioactive isotope can. It is also possible to label the albumin fusion proteins with a fluorescent compound. When the fluorescently labeled antibody is exposed to light of the proper wave length, its presence can then be detected due to fluorescence.

The albumin fusion protein can also be- detectably labeled using fluorescence emitting metals such as 152Eu, or others of the lanthanide series.

These metals can be attached to the antibody using such metal chelating groups as diethylenetriaminepentacetic acid DTPA or ethylenediaminetetraacetic acid EDTA. The albumin fusion proteins can also can be detectably labeled. The presence of the chemiluminescent-tagged albumin fusion protein is then determined by detecting the presence of luminescence that arises during the course of a chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, theromatic acridinium ester, iniidazole, acridinium salt and oxalate ester.

Likewise, a bioluminescent compound may be used to label albumin fusion proteins of the present invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems in, which a catalytic protein increases the efficiency of the chemiluminescent reaction. The presence of a bioluminescent, protein is determined by detecting the presence of luminescence.

Important bioluminescent compounds for purposes of labeling are luciferin, luciferase and aequorin. Transgenic Organisms -Transgenic organisms that express the albumin fusion proteins of the invention are also included in the invention. Transgenic organisms are genetically modified organisms into which recombinant, exogenous or cloned genetic material has been transferred. Such genetic material is often referred to as a transgene. The nucleic acid sequence of the transgene may include one or more transcriptional regulatory sequences and other nucleic acid sequences such as introns, that may be necessary for optimal expression and secretion of the encoded protein.

The transgene may be designed to direct the expression of the encoded protein in a manner that facilitates its recovery from the organism -or from a product produced by the organism, e. The transgene may consist of nucleic acid sequences derived from the genome of the same species or of a different species than the. The term "germ cell line transgenic organism" refers to a transgenic organism in which the genetic alteration or genetic information was introduced into a germ line cell, thereby conferring- the ability- of the traasgenic organism to transfer the genetic information to offspring.

If such offspring in fact possess some or -all of that alteration or genetic information, then they too are transgenic organisms. The alteration or genetic information may be foreign to the species of organism to which the recipient belongs, foreign only to the particular- individual recipient, or may be genetic information already possessed by the recipient.

In the last case, the altered or introduced gene may be expressed differently than the native gene.

Brazilian compare.xsl File Recover PC Tools, Téléchargement recommandé (WinThruster): Optimisez votre PC et réparez LNG Windows C: Program Files (x86) File Recover ugLng . medium was removed and ml of extraction buffer ((20 mM HEPES pH , M NaC1, 1 Triton X , SDS, 2 mM Na3VO4, 2 niM Na4P2O7 and a. Liste de tous les fichiers avec XSL file extension (Données).

Transgenic -animals can be produced by a variety. The method of introduction of nucleic acid fragments into recombination competent mammalian cells can be by any method which favors co-transformation of multiple nucleic acid molecules.

Detailed procedures for producing transgenic animals are readily available to one skilled in the art, including the disclosures in U. A number of recombinant or transgenic mice have- been produced, including those which express an activated oncogene sequence U.

While mice and rats remain the animals of choice for most transgenic experimentation, in some instances it is preferable or even necessary to use alternative animal species. Animal Science 75 Promoters that control the genes encoding milk proteins are preferred, for example the promoter for casein, beta Iactoglobulin, whey acid protein, or lactalbumin see, e. Plant transformation procedures used to introduce foreign nucleic acids into plant cells or protoplasts are known in the art e.

Methods for generation of genetically engineered plants are further described in US Patent No. Pharmaceutical or Therapeutic Compositions The albumin fusion proteins of the invention or formulations thereof may be administered by any conventional method including parenteral e.

The treatment may consist of a single dose or a plurality of doses over a period of time. While it is possible for an albumin fusion protein of the invention to be administered alone, it is preferable to present it as a pharmaceutical-formulation, together with one or more acceptable carriers.

The carrier s must be "acceptable" in the sense of being compatible with the albumin fusion protein and not deleterious to the recipients thereof. Typically, the carriers will be water or saline, which will be sterile and pyrogen free.

Albumin fusion proteins of the invention are particularly well suited to formulation in aqueous carriers such as sterile pyrogen free water, saline or other isotonic solutions because of their extended shelf- life in solution. For instance, pharmaceutical compositions of the invention may be formulated well in. For example, wherein the Therapeutic protein is JGH, EPO, alpha-IFN or beta-1 FN, formulations containing the albumin fusion protein may be prepared taking into account the extended shelf-life of the albumin fusion protein in aqueous formulations.

As exhibited in Table 2, most Therapeutic proteins are unstable with short shelf-lives after formulation with an aqueous carrier. As discussed above, the shelf-life of many of these Therapeutic proteins are markedly increased or prolonged after fusion to HA.

Powder should be stored Serono im at Rm Temp. After reconstitution store 4 - 8 C for up to 14d. Specifically, aerosol includes a gas-borne suspension of -droplets of an albumin -fusion protein of the instant invention, as may be produced in a metered dose inhaler or nebulizer, or in a mist-sprayer.

Aerosol also includes a dry powder composition of a compound of the instant invention suspended in air or other carrier gas, which may be delivered by insufflation from an inhaler device, for example. For instance,- for human use, both the Therapeutic protein and albumin portions of the albumin fusion protein will typically be human. In some cases, wherein either component is non human-derived, that component may be humanized by substitution of key amino acids so that specific e-pitopes appear to the human immune system to be human in nature rather than foreign.

Such methods include the step of bringing into association the albumin fusion protein with the carrier that constitutes one or more accessory ingredients. The formulations may be presented in unit-dose or multi-dose containers, for example sealed ampules, vials or syringes, and may be stored in a freeze-dried lyophilised condition requiring only the addition of the, sterile liquid carrier, for example water for injections, immediately prior to use.

Extemporaneous injection solutions and suspensions may be prepared from sterile powders. Dosage formulations may contain the Therapeutic protein portion at a lower molar concentration or lower dosage compared to the non- fused standard formulation for the Therapeutic protein given the extended serum half-life exhibited by many of the albumin fusion proteins of the invention.

Growth hormone is typically administered at 0. As described above, formulations of the invention may be in aqueous form and may be stored under less than ideal circumstances without significant loss of therapeutic activity.

Albumin fusion proteins of the invention can also be included in nutraceuticals. For instance, certain albumin fusion proteins of the invention may be administered in natural products, including milk or milk product obtained from a transgenic mammal which expresses albumin fusion protein.

Such compositions can also include plant or plant products obtained from a transgenic plant which expresses the albumin fusion protein. The "effective amount" for purposes herein is thus determined by such considerations. More preferably, this dose is.

Microscopy image of a representative bacterial film showing a homogeneous and of effective genetic tools for the construction of isogenic mutants in this organism. o Micro injection du peptide Pc dans des cellules MCF10A. mM L-glutamic acid (pH ), ml of 1 mM -NAD, ml of deionized water, and ml of. needs reliable and noninvasive tools, spheroids could help to (15 mM Tris HCl , pH , M NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, and unsolved disease, meaning that no recovery treatment exists and only the eradication of Atomic Force Microscopy: Application to Investigation of. the cells were allowed to recover for one hour at 37 C in 5 replaced by 10 mM Tris-HCl, pH , M NaCl, Tween such inhibitors would provide more rapid and reversible tools than couverte d un film doré sur une face.

An intravenous bag solution may also be employed. The term "parenteral" as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal.

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Sustained-release matrices include polylactides U. Ordinarily, the liposomes are of the small about Angstroms unilamellar type in which -the. Other controlled release systems are discussed in the review by Langer Science For example, the formulation preferably does not include oxidizing agents and other compounds that are known to be deleterious to the Therapeutic.

Then, if necessary, the product is shaped into the desired formulation. Preferably the carrier is a parenteral carrier, more preferably a solution that is isotonic with the blood of the recipient.

The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that. The albumin fusion protein is typically formulated in such vehicles at a concentration. It will be understood that the use of certain of the foregoing excipients, carriers, or stabilizers will result in the formation of polypeptide salts.

Sterility is readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes e. In a specific and preferred embodiment, the Albumin fusion protein formulations comprises 0. In another specific and preferred embodiment, the Albumin fusion protein formulations consists 0.

Finally, polysorbate has been added as a generic surfactant, which lowers the surface tension of the solution and lowers non- specific adsorption of the albumin fusion protein to the container closure system. This includes presentations in which the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and also procedures in which the combined agents are administered separately but simultaneously, e. Administration "in combination" further includes the separate administration of one of the compounds or agents given first, followed by the second.

Administration "in combination" further includes the separate administration of one of the- compounds or agents given first, followed by the second. In another specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with warfarin. In another specific embodiment, compositions of the invention are administered in 93 CA combination with warfarin and aspirin.

In another specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with heparin. In another specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with heparin and aspirin. Thrombolytic drugs that may be administered with the compositions of the invention include, but are not limited to, -plasminogen, lys-plasminogen, -alpha2-antiplasmin, streptokinae e. In a specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with tissue plasminogen activator and aspirin.

Antiplatelet drugs that may be administered with the compositions of the invention include, but are not limited to, aspirin, dipyridamole e. Additional protease inhibitors.

Additional antiretroviral agents include integrase inhibitors. Other immunosuppressive agents that. In a-specific embodiment, immunosuppressants may be used to.

In an additional embodiment, the compositions of the invention are administered alone 25 or in combination with an anti-angiogenic agent. Such transition metal species may form transition metal complexes. Representative examples -of vanadium complexes include oxo vanadium complexes such as vanadate and vanadyl complexes. Suitable vanadyl complexes include, for example, vanadyl acetylacetonate and vanadyl sulfate including vanadyl sulfate hydrates such as vanadyl sulfate mono- and trihydrates.

Representative examples of tungsten- and molybdenum complexes also include oxo complexes. Suitable tungstate complexes include ammonium tungstate, calcium tungstate, sodium tungstate dihydrate, and tungstic acid. Suitable tungsten oxides include tungsten IV oxide and tungsten VI oxide. Suitable oxo molybdenum complexes include molybdate, molybdenum oxide, and molybdenyl complexes.

Suitable molybdate complexes include ammonium molybdate and its hydrates, sodium molybdate and its hydrates, and potassium molybdate and its hydrates. Suitable molybdenum oxides include molybdenum VI oxide, molybdenum VI oxide, and molybdic acid.

Suitable molybdenyl complexes include, for example, molybdenyl acetylacetonate. Other suitable tungsten and molybdenum complexes include hydroxo derivatives derived from, for example, glycerol, tartaric acid, and sugars. A wide variety of other anti-angiogenic factors may also be utilized within the context of the.

Anti-angiogenic agents that may be administed in combination with the compounds of the invention may work through a variety of mechanisms including, but not limited to, inhibiting proteolysis of the extracellular matrix, blocking the function of endothelial cell- extracellular matrix adhesion molecules, by antagonizing the function of angiogenesis inducers such as growth factors, and inhibiting integrin receptors expressed on proliferating endothelial cells.

Other anti- angiogenic agents act to indirectly inhibit angiogenesis. In another embodiment, the polynucleotides encoding a polypeptide of the present invention are administered in combination with an angiogenic protein, or polynucleotides encoding an angiogenic protein.

In additional embodiments, compositions of the invention are administered in combination with a chemotherapeutic - -agent. Chemotherapeutic agents that may. In one embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with one or more of the following drugs: infliximab also known as RemicadeTM Centocor, Inc.

Ina specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with Rituximab. In a specific embodiment, compositions of the invention are administered in combination with tositumomab. The anti-CD20 antibodies may optionally be associated with radioisotopes, toxins or cytotoxic prodrugs. Zevalint may be associated with one or more radisotopes. Treatments for uterine motility disorders include, but are not limited to, estrogen drugs such as conjugated estrogens e.

Treatments for gastrointestinal disorders that. The invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more of the ingredients of the pharmaceutical compositions comprising albumin fusion proteins of the invention.

A preferred approach for in vivo introduction of nucleic acid into a cell is by use of a viral vector containing. Additionally, molecules encoded within the viral vector, e. These vectors provide efficient delivery of nucleic acids into cells, and the transferred nucleic acids are stably integrated into the chromosomal DNA of the host.

The development of specialized cell lines termed "packaging cells" which produce only 10- replication-defective retroviruses has increased the utility of retroviruses for gene therapy, and defective retroviruses are characterized for use in gene transfer for gene therapy purposes for a review see Miller, A.

A replication defective retrovirus can be packaged into virions which can be used to infect a target cell through the use of a helper virus by standard techniques. Protocols for producing recombinant retroviruses and for infecting 15 cells in vitro or in vivo with such viruses can be found in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. Greene Publishing Associates, , Sections 9. Another viral gene delivery system useful in the present invention uses adenovirus-derived vectors.

The genome of an adenovirus can be manipulated such that it 20 encodes and expresses a gene product of interest but is inactivated in terms of its ability to replicate in a normal lytic viral life cycle. See, for example, Berkner et al.

Suitable adenoviral vectors derived from the adenovirus strain Ad type 5 d or other strains of adenovirus e. Furthermore, the virus particle is relatively stable and amenable to purification and concentration, and as above, can be modified so as to affect the spectrum of infectivity.

Additionally, introduced adenoviral 30 DNA and foreign DNA contained therein is not integrated into the genome of a host cell but remains episomal, thereby avoiding potential problems that can occur as a result of insertional- mutagenesis in situations where introduced DNA becomes integrated into the host genome e.

Moreover, the carrying capacity of the adenoviral genorne for foreign DNA is large up to 8 kilobases relative to other gene delivery vectors Berkner et al.

Gene delivery systems for a gene encoding an albumin fusion protein of the invention can be introduced into a patient by any of a number of methods. For instance, a pharmaceutical preparation of the gene delivery system can be introduced systemically, e. In other embodiments, initial delivery of the recombinant gene is more limited with introduction into the animal being quite localized.

For example, the gene delivery vehicle can be introduced by catheter see U. Patent 5,328,470 or by Stereotactic injection e. The pharmaceutical preparation of the gene therapy construct can consist essentially of the gene delivery system in an acceptable diluent, or can comprise a slow release matrix in which the gene delivery vehicle is imbedded.

Additional Gene Therapy Methods Also encompassed by the invention are - gene therapy methods for treating or preventing disorders, diseases and conditions. This method requires a polynucleotide which codes for an albumin fusion protein of the present invention operatively linked to a promoter and any other genetic elements necessary for the expression of the fusion protein by the target tissue.

Thus, for example, cells from a patient may be engineered with. Such methods are well-known in the art. For example, see Belldegrun, A. Cancer 114 CA Inst. In one embodiment, the cells which are engineered are arterial cells.

The arterial cells may be reintroduced into the patient through direct injection to the artery, the tissues surrounding the artery, or through catheter injection.

As discussed in more detail below, the polynucleotide constructs can be delivered by any method that delivers injectable materials to the cells of an animal, such as, injection into the interstitial space of tissues heart, muscle, skin, lung, liver, and the like. The polynucleotide constructs may be delivered in a pharmaceutically acceptable liquid or aqueous carrier.

In one -embodiment, polynucleotides encoding the albumin fusion proteins of the present invention is delivered as a naked polynucleotide. The term "naked" polynucleotide, DNA or RNA refers to sequences that are free from any delivery vehicle that acts to assist, promote or facilitate entry into the cell, including viral sequences, viral particles, liposome formulations, lipofectin or precipitating agents and the like.

Such methods are described, for example, in U. The polynucleotide vector constructs used in the gene therapy method are. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

Any strong promoter known to those skilled in the art can be used for driving the expression of the polynucleotide sequence. The promoter also may be the native 115 CA promoter for the gene corresponding to the Therapeutic protein portion of the albumin fusion proteins of the invention.

Unlike other gene therapy techniques, one major advantage of introducing naked nucleic acid sequences into target cells is the transitory nature of the polynucleotide synthesis in the cells. Studies have shown that non-replicating DNA sequences can be introduced into cells to provide production of the desired polypeptide for periods of up to six months.

Interstitial space of the tissues comprises the intercellular, fluid, mucopolysaccharide matrix among the reticular fibers of organ tissues, elastic fibers in the walls of vessels or chambers, collagen - fibers of fibrous tissues, or that same matrix within connective tissue ensheathing muscle cells or in the lacunae of bone. It is similarly the space occupied by the plasma of the circulation and the lymph fluid of the lymphatic channels.

Delivery to the interstitial space of muscle tissue is preferred for the reasons discussed below. They may be conveniently delivered by injection into the tissues comprising these cells. They are preferably delivered to and expressed in persistent, non-dividing cells which are differentiated, although delivery and expression may be achieved in non-differentiated or less completely differentiated cells, such.

For the naked nucleic acid sequence injection, an effective dosage amount of DNA or RNA will be in the range of from about. The appropriate and effective dosage of nucleic acid sequence can readily be determined by those of ordinary skill in the art and may depend on the condition being treated and the route of administration.

However, -other parenteral routes may also be used, such as, inhalation of an aerosol formulation particularly for delivery to lungs or bronchial tissues, throat or mucous -membranes- of the nose. In addition, naked DNA constructs can be delivered to arteries during angioplasty by the catheter used in the procedure. CA known in the art. The constructs may also be delivered with delivery vehicles such as viral sequences, viral particles, liposome formulations, lipofectin, precipitating agents, etc.

Such methods of delivery are known in the art. In certain embodiments, the polynucleotide constructs are complexed in a liposome preparation. Liposomal preparations for use in the instant invention include cationic positively charged, anionic negatively charged and neutral preparations. However, cationic liposomes are particularly preferred because a tight charge complex can be formed between the cationic liposome and the polyanionic nucleic acid.

Cationic liposomes have been shown to mediate intracellular delivery of plasmid DNA Feigner et al. Other cationic liposomes can be prepared from readily available materials using techniques well known in the art. Similar methods can be used to prepare liposomes from other cationic lipid materials.

Similarly, anionic and neutral liposomes are readily available, such as from Avanti Polar Lipids Birmingham, Ala. Such materials include phosphatidyl, choline. Methods for making liposomes using these materials are well known in the art. For example, commercially dioleoylphosphatidyl choline DOPC, dioleoylphosphatidyl glycerol DOPG, and dioleoylphosphatidyl ethanolamine DOPE can be used in various combinations to make conventional liposomes, with or without the addition 117 CA of cholesterol.

The sample is placed under a vacuum pump overnight and is hydrated the following day with deionized water. Alternatively, negatively charged vesicles can be prepared without sonication to produce multilamellar vesicles. Other methods are known and available to those of skill in the art.

The various liposome-nucleic acid complexes are prepared using methods well known in the art. For example, MLVs containing nucleic acid can be prepared by depositing a thin. SUVs are prepared by extended sonication of MLVs to produce a homogeneous population of unilamellar liposbmes.

The material to be entrapped is added to a suspension of. The liposome and DNA form a very stable complex due to binding of the positively charged liposomes to the cationic DNA. SUVs find use with small nucleic acid fragments. LUVs are prepared by a number of methods, well known in the art. Preferably, the ration will be from about 5:1 to about More preferably, the ration will be about 3:1 to about Still more preferably, the ratio will be about In certain embodiments, cells are engineered, ex.

The retroviral plasmid vector is employed to transduce packaging cell lines to form producer cell lines. De plus, la corruption du fichier Czech. Dans les résultats de recherche, recherchez et cliquez sur Restaurer système. Restaurez votre ordinateur sur cette image de sauvegarde.

Étape 2: Si vous avez récemment installé Glary Utilities ou logiciel associé, désinstallez puis essayez de réinstallerGlary Utilities logiciel.